Unidad de Microscopia Avanzada y Bifotónica

La UMAB está comprometida con el desarrollo de nuevos instrumentos y métodos en el campo de la biofotónica con el objetivo final de dar respuesta a preguntas y necesidades biomédicas de forma cuantitativa. El desarrollo de instrumentación y métodos están motivados por los problemas biológicos y biomédicos que se abordan en la UMAB, y al mismo tiempo nuestras preguntas biológicas son impulsadas por los desarrollos tecnológicos y métodos de vanguardia de la UMAB. Esta interacción virtuosa entre tecnología en el estado del arte y preguntas biomédicas son la sinergia clave que motiva nuestra investigación. Dentro de la área de desarrollo nuestra unidad se enfoca en instrumentos de vanguardia para abrir nuevas fronteras en la investigación biomedica, en particular nos centramos en el desarrollo de tecnologías multifotonica, óptica no lineal, fibras ópticas y espectroscopia resuelta en el tiempo e hiperespectral. Anualmente ofrecemos taller para difundir el uso de instrumentación, métodos y aplicaciones de herramientas biofotónicas avanzados. En la UMBA utilizamos herramientas de espectroscopia en microscopia para estudiar dinámica de fluorescencia como FCS, FLIM, imágenes hiperespectrales, diagramas de fasores, microscopía no lineal (SHG y THG), multifotón, imágenes de tejido profundo, RICS, seguimiento orbital 3D , N&B, iMSD, pCF y 2DpCF, entre otros. Nuestra unidad tiene un alto compromiso de servicio por lo cual los usuarios podrán recibir una capacitación en el uso de instrumentos de alta tecnología y les enseñará sobre el análisis y procesamiento de los resultados.

Miembros/Members:

Leonel Malacrida (PhD) Responsable/Head

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 Chan Zurkerberg Initiative "Imaging Scientist" Ciclo 2 2020

Equipo/Team:

MSc. Ma José García (Asistente Departamento de Fisiopatología G2 interino, Estudiante de Doctorado ProInBio, Beca Doctorado Comisión Académica de Posgrado 2020).

Proyecto de Investigación: "Microscopia no-lineal y por tiempo de vida en modelos experimentales de lesión pulmonar: Evaluación de su utilidad diagnostica a través de aprendizaje automático"

Ana Laura Suarez (Tec. Anatomía Patológica, Departamento de Fisiopatología) 

Proyecto de Investigación: "Desarrollo de un altas metabólico tisular para estudiar disfunción multiorgánica"

Lineas de investigación/Research and Development:

1- Proyectos impulsados por el desarrollo de tecnología, métodos y aplicaciones en el campo de la Biofotónica/Techological Driven projects.

a) “Fluorescence Lifetime Assisted in vivo Detection of Skin Cancers with a Portable Point-of-Care Fiber Optical Device.”, financiación NIH P41-GM103540. PI's: Leonel Malacrida y Enrico Gratton. U$S 50000 

b) “Microscopia de dos fotones resuelta en el tiempo de vida en el Hospital Universitario: un microscopio en el estado de arte para responder preguntas en biomedicina.”, financiado por CSIC Equipamiento pesado 2018. PI's: Leonel Malacrida y Javier Hurtado. $U 38500000

 c) "Desarrollo de un dispositivo óptico para el diagnóstico rápido y portable de SARS-CoV2 con proteínas ingenierizadas", financiado por Fundación Manuel Pérez, Llamado especial Corona virus 2019. PIs: Leonel Malacrida y.Sergio Pantano (IPMON) U$S 30000

2- Proyectos biologicos "guiados por hipotesis"/ Biological Driven Projects.

a) “Una aproximación a las enfermedades neurodegenerativas mediante microscopía y espectroscopia de fluorescencia in vivo. Rol de la segregación de fases líquido-líquido en la fisio(pato)logía celular.”, financiado por FCE Mod II 2018-ANII. PI: Leonel Malacrida. $U 1000000

b) “Microscopia no-lineal y por tiempo de vida en modelos experimentales de lesión pulmonar: Evaluación de su utilidad diagnostica a través de aprendizaje automático”, financiado por CSIC I+D 2018. PI: Leonel Malacrida. $U 1000000

3- Proyectos de Extension o desarrollo institucional/Institutional and social projects.

a) "Cooperación para el desarrollo de capacidades en microscopia avanzada con miras a cooperación para el desarrollo de capacidades en microscopia avanzada con miras a constituir la red latinoamericana de microscopía", Fianaciado por el Fondo conjunto de cooperacion Mexico-Uruguay (AMEXCID-AUCI). Responsables: Andres Kamaid (IPMON), Christopher Wood (UNAM), Leonel Malacrida (UdelaR). U$S100000

b) "Desarrollo de una Unidad de Bioimagenología Avanzada en Latinoamerica". Financiado por Chan Zurkerberg Initiative en su programa "Imaging Scientist" Ciclo 2 - 2020 (la UBA es un esfuerzo mixto de la Universidad de la República y el Institut Pasteur de Montevideo). U$S 370000 (5 años).

Capacidades instrumentales de la UMAB/ Resources at the UMAB

 1- Microscopio "home-buit" de dos fotones con resultución de tiempo de vida y FCS. Bloque epifluorescente Nikon Ti-S, laser pulsado basado en fibra 780 nm (Calmar), 2 dectectores pesudo conteo de fotones (GaAsP Hamamatsu), FLIMBos 320 (ISS), platina motorizada x/y (ASI), lente electrico (Optotune), CO2 y temperatura controlada, mesa óptica con aislación pasiva (TMC) escaner glavanometrico x/y ultrarápido (Cambridge Technologies).

• FLIM
• FRET
• Phasor plots
• FCS (single point, line, circular, diffusion map)
• RICS (crossRICS)
• N&B (crossN&B)
• pCF (pCOMB)
• 2D y 2D Particle Tracking 
• epifluorescence (camera based)

2- Instrumento basado en Fibras ópticas para medidas de tiempo de vida y espectral. Detector Hamamatsu de 2x2, A320 fastFLIMbox (ISS), Laser Diodo 370 nm modulado hasta 300MHz (ISS), Laser pulsado 355 nm (Markettech), Fibras opticas (ThorLabs).

3- Espectrometros de alta resolución y velocidad para diffuse optical spectroscopic imaging (DOSI) . HR4000 y 2x USB200 (Ocean Optics).

4- Computadora de alto rendimiento para procesamiento y análisis de imagenes. PC de escritorio procesador Intel Core i7-3779 CPU @ 3.40HGHz, 32Gb DDR3 RAM, 128GB SSD, Disco duro SATA 1Tb, tarjeta de video NVIDIA GeForce GT 640 DDR3 2Gb, dos monitores BenQ GL2450 26 pulgadas.

5- Software para análisis y procesamiento de imagenes comercial y de codigo abierto. SimFCS for images (G-Soft, Ilinois-USA), Fiji & ImageJ (NIH, Bethesda-USA), Icy (Pasteur Paris, France) and codigo y rutinas customizadas en MatLab (MathWorks).

 
Cursos dicatados:

1er Workshop de Micrsocopia de Fluorescencia Avanzada y Biofotónica.

25 al 28 de Noviembre de 2019.

Unidad de Microscopia Avanzada y Bifotónica

Hospital de Clínicas -  Universidad de la República

Organizador: Dr. Leonel Malacrida

Profesores Internacionales invitados:

• Dr. Enrico Gratton (LFD-UCI-USA)
• Dr. David Jameson (U. Hawaii-USA)
• Dra. Susana Sanchez (U. Concepción-Chile)
• MSc. Andrés Saraleguí (UNAM-México).
  
  

Profesores invitados locales:

• Dra. Florencia Irigoín (FMed)
• Dra. Julia Alonso (FIng)
• Dr. Federico Lecumberry (FIng).

Lunes 25 de Noviembre

08:30-09:00 – Palabras inaugurales e introducción al curso. Leonel Malacrida

09:00-09:45 – Lecture 1. Leonel Malacrida. Introducción a la fluorescencia y métodos fluorescentes.

09:45-10:30 – Lecture 2. Leonel Malacrida: Fundamentos de la instrumentación avanzada de fluorescencia y microscopia de fluorescencia.

Break

11:00-11:45 – Lecture 3. Enrico Gratton: Introducción a la Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH)

Almuerzo

13:30-14:00 – – Charla de aplicaciones #1. Susana Sánchez: Detección de proteínas ribosomales en levaduras mediante análisis de PCH.

14:00 – 14:45: Lecture 4. Enrico Gratton: Aplicaciones de Raster image correlation spectroscopy (RICS) para medir la difusión molecular in vivo.

14:45-15:30 – Lecture 5. Enrico Gratton: Análisis de Numero y Brillo (N&B) para estudiar la oligomerización y concentración de proteínas en la célula.

Break

16:30 – 17:15 - Lecture 6. Leonel Malacrida: El método de pair-correlation y sus aplicaciones (pCF) para descifrar barreras y obstáculos a la difusión in vivo.

Martes 26 de Noviembre

09:00-09:45 – Lecture 7. David Jameson: Introducción a la medida de tiempo de vida y los gráficos de Fasores.

09:45-10:30 – Lecture 8. Enrico Gratton: Los gráficos de Fasores para el análisis e interpretación de FLIM y FRET.

Break

11:00-11:45 – Lecture 9. Leonel Malacrida: Los fasores espectrales y sus aplicaciones para el análisis de microscopia hiperespectral.

11:45-12:15 – Charla de aplicaciones #2. Susana Sánchez: Aplicaciones de FLIM-Fasores para responder preguntas biologicas.

Almuerzo

13:30-14:15 – Charla de aplicaciones #3. Enrico Gratton: Aplicaciones de FLIM-Fasores para estudios del metabolismo celular en Biomedicina.

14:15 – 14:35 - Charla de aplicaciones # 4. Leonel Malacrida: Concentración absoluta in vivo de NADH. FLIM-Phasor y metabolismo, algunas consideraciones.

14:45 – 15:45 - – Simulaciones de FCS y análisis de datos RICS y N&B. Leonel Malacrida – Susana Sanchez - Enrico Gratton.

Break

16:30-17:30 – Continuación de las simulaciones de FCS y análisis de datos RICS y N&B.

Miércoles 27 de Noviembre

09:00-09:45 – Lecture 10. Enrico Gratton: Seguimiento de partícula única en 3D y sus aplicaciones.

09:45-10:30 – Lecture 11. Leonel Malacrida: Microscopia de iluminación en lamina (SPIM) y sus aplicaciones.

Break

11:00-11:30 – Charla de aplicaciones #5 - David Jameson: Aplicaciones de N&B en la oligomerización de proteínas en células in vivo.

11:30: - 12:00 - Charla de aplicaciones #6. Enrico Gratton: Microscopía DIVER para aplicaciones en imágenes de tejidos en profundidad y microscopia no lineal (generación de armónicos).

Almuerzo

13:30-15:30 – Entrenamiento en FLIM/Hiperespectral/Phasor con simulaciones en computadora. Leonel Malacrida – Susana Sanchez - Enrico Gratton.

15:30-17:30 – Sección de poster con los estudiantes participantes (se les solicitara a los estudiantes que presente un poster de su proyecto de investigación).

Jueves 28 de Noviembre

09:00-09:30 – Charla de aplicaciones #7. Andrés Saraleguí. Observando tejidos en profundidad: Microscopía Multifotónica y Aclaramiento de muestras.

09:30-10:00 – Charla de aplicaciones #8. Susana Sánchez: Fluctuaciones de la función de GP y su aplicación en el estudio de la dinámica de membranas.

Break

10:30-11:00 – Charla de aplicaciones #9. Florencia Irigoín. Dinámica de las membranas en la cilia primaria por microscopia hiperespectral y fluorescencia de LAURDAN.

11:00-11:30 – Charla de aplicaciones #11. Federico Lecumberry. Procesamiento de señales y aprendizaje automático aplicado a imágenes biomédicas.

11:30-12:00 – Charla de aplicaciones #12. Julia Alonso. Óptica Computacional aplicada a la Microscopía de Fluorescencia.

Almuerzo

13:30 – 14:00 - Charla de aplicaciones #13. Leonel Malacrida: Ensayo de iMSD y 2D-pCF para el análisis de difusión de moléculas dentro de la célula in vivo.

14:00 – 15:00 - Lecture 12. Cierre del Workshop y Seminario especial. David Jameson: Una nano-historia acerca de la fluorescencia.

Estudiantes participantes:

Apoyos para el curso:

Foto final de curso

Publicaciones

2021

The Phasor Plot: A Universal Circle to Advance Fluorescence Lifetime Analysis and Interpretation

Leonel Malacrida,# Suman Ranjit,# David M. Jameson, and Enrico Gratton.

Annu. Rev. Biophys. 2021. 50:X–X https://doi.org/10.1146/annurev-biophys-062920-063631

(# primer autor en pie de igualdad)

2020

Barriers to diffusion in cells: visualization of membrane-less particles in the nucleus. 

Leonel Malacrida, Per Niklas Hedde, Belen Torrado, Enrico Gratton. The Biophysicist (2020) 1 (2): 9.

CAPRYDAA, an anthracene dye analog to LAURDAN: a comparative study using cuvette and microscopy

2019

Determination of the metabolic index using the fluorescence lifetime of free and bound nicotinamide adenine dinucleotide using the phasor approach

The DIVER Microscope for Imaging in Scattering Media

StarD5: an ER stress protein regulates plasma membrane and intracellular cholesterol homeostasis

A novel nitroalkene‐α‐tocopherol analogue inhibits inflammation and ameliorates atherosclerosis in Apo E knockout mice

2018

Differences between FLIM phasor analyses for data collected with the Becker and Hickl SPC830 card and with the FLIMbox card

(# primer autor en pie de igualdad)

Fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging data using the phasor approach

(# primer autor en pie de igualdad)

LAURDAN fluorescence and phasor plots reveal the effects of a H2O2 bolus in NIH-3T3 fibroblast membranes dynamics and hydration

2017

sideSPIM–selective plane illumination based on a conventional inverted microscope

Spectral phasor analysis reveals altered membrane order and function of root hair cells in Arabidopsis dry2/sqe1-5 drought hypersensitive mutant

A multidimensional phasor approach reveals LAURDAN photophysics in NIH-3T3 cell membranes

2016

Spectral phasor analysis of LAURDAN fluorescence in live A549 lung cells to study the hydration and time evolution of intracellular lamellar body-like structures

(* autor correspondiente)

Measurements of absolute concentrations of NADH in cells using the phasor FLIM method

2015 y anteriores

Model-free methods to study membrane environmental probes: a comparison of the spectral phasor and generalized polarization approaches

Ver corrección:

Erratum: Model-free methods to study membrane environmental probes: a comparison of the spectral phasor and generalized polarization approaches (2015 Methods Appl. Fluoresc. 3 …

Journals cover

On the cover: The cover image is based on the Research Article Differences between FLIM phasor analyses for data collected with the Becker and Hickl SPC830 card and with the FLIMbox card by Suman Ranjit et al., DOI: https://doi.org/10.1002/jemt.23061.











Patentes

 Selective plane illumination in the conventional inverted microscope geometry by side illumination

Presentación de la Unidad Mixta de Bioimagenología Avanzada (UBA).  Lunes 14 de 2020, se inauguro en el Institut Pasteur de Momntevideo y con la presencia del Rector Prof. Rodrigo Arim (UdelaR), el Director Ejecutivo Dr. Carlos Batthyany (IPMON), la pro-Rectora de Investigación Prof. Dra. Cecilia Fernandez (UdelaR) y el Director Academico Dr. José Badano (IPMON) la UBA como una iniciativa mixta de la UdelaR y el IPMON, la cual será liderada por el Dr. Leonel Malacrida y participaran investigadores de ambas instituciones. Link Aqui.

Presentación en el ciclo de seminario ¿Quién es Quién en Biofísica AUGM? del grupo Biofísica de AUGM: "Descifrando el camino de proteínas en la célula in vivo a partir de la función de correlación de pares 2D y los mapas de comectividad"

Link aquí

Presentacion en el ciclo de seminarios Institut Pasteur de Montevideo: "The DIVER microscope: a multiphoton instrument to deep dive within the scattering tissue." 

link aquí

Presentacion en el ciclo de Webinarios de Biofísica en español Kognite: "Una nueva dimensión para la microscopía de fluorescencia hiperespectral y de tiempo de vida: el espacio de los gráficos de fasores". 

Link aquí

Presentación en la celebración de los 30 años de la Licenciatura en Bioquímica y los 20 años del Instituto de Química Biológica, de la Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

Link aquí

Entrevista el Dr. Leonel Malacrida SobreCiencia, Radio Uruguay 1050 AM. 2019

El primer microscopio de dos fotones del país, comenzará a funcionar este año.

Entrevista el Dr. Leonel Malacrida SobreCiencia, Radio Uruguay 1050 AM. 2018

El Clínicas tendrá el primer microscopio de dos fotones del país

Entrevista en La Diaria (espacio Ciencia) "Udelar e Institut Pasteur inauguraron Unidad de Bioimagenología Avanzada".

Se llama a interesad@s para unirse al equipo de trabajo del UMAB, los objetivos de investigación del grupo tiene un corte sustancial de transdisciplinariedad por lo cual se buscan candidatos con interés de trabajar en las fronteras de la Biología Celular/Molecular, Bioquímica, Biomedicina, Biofotónica y Bioingeniería.

Se contemplan la realización de tesis de grado, posgrado y/o estancias postdoctorales.

Los proyectos en curso son los siguientes:

1-Caracterización biofísica in vivo por herramientas de microscopia avanzada de fluorescencia de las separaciones de fase liquido-liquido y liquido-solida de FUS (Fused in Sarcoma, RNA binding protein) como responsable del desarrollo y progresión de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).

Se realizaran líneas neuronales con expresión estable de versiones fusionadas de FUS (así como mutaciones puntuales) a proteínas fluorescentes y se analizaran las características fisicoquímicas de las fases liquida-liquida y liquida-solida por sensores de relajación por entorno (actividad de agua con ACDAN) y viscosidad (rotor molecular TPAP). Además se estudiaran por microscopio bifotónica y de tiempo de vida la influencia del estado metabólico celular en la progresión de la segregación líquido-solido como mecanismo de la fisiopatología de la FUS.  

Proyecto “Una aproximación a las enfermedades neurodegenerativas mediante microscopía y espectroscopia de fluorescencia in vivo. Rol de la segregación de fases líquido-líquido en la fisio(pato)logía celular.”, financiado por FCE 2018-ANII.

2-Desarrollo de nuevos métodos de diagnostico y caracterización de la Lesión pulmonar aguda por microscopia de dos fotones y resuelta en el tiempo de vida (FLIM).

Se relaciona con el uso de la autofluorescencia (NADH/FAD+) como indicador del metabolismo tisular, generación de segundo y tercer armónico, imagen en tejido con dispersión, etc. En un modelo experimental de ratones C57BL/6 con lesión pulmonar aguda por instilación pulmonar de lipopolisacarido bacteriano. Se pretende incorporar herramientas de inteligencia artificial (machine learning) al análisis y procesamiento de imágenes de FLIM.

Proyecto “Microscopia no-lineal y por tiempo de vida en modelos experimentales de lesión pulmonar: Evaluación de su utilidad diagnostica a través de aprendizaje automático”, financiado por CSIC I+D 2018

3- Desarrollo y aplicación un nuevo dispositivo basado en fibras ópticas para la caracterización in vivo del metabolismo tisular por la autofluorescencia.

El proyecto comprende el armado, puesta a punto y aplicación de este nuevo dispositivo de imagen con resolución de tiempo de vida e hiperespectral utilizando arreglo de detectores con conteo de fotones y laser UV pulsado/modulado. El instrumento tiene como objetivo ser utilizado en in vivo como sondas intra-vital, así como en la definición de márgenes en cirugía oncologica.

Proyecto “Fluorescence Lifetime Assisted in vivo Detection of Skin Cancers with a Portable Point-of-Care Fiber Optical Device.”, financiación NIH P41-GM103540

4-Ensamblado y puesta a punto de un microscopio de dos fotones con detección de conteo de fotones y resolución de tiempo de vida.

El primer microscopio bifotónico del Uruguay será ensamblado a partir de la adquisición de sus componentes (laser, glavo-scanner, detectores, FLIMbox card), por lo cual será un proyecto con un claro corte ingenieril y con la posibilidad de cubrir todos los aspectos que hacen al funcionamiento de un microscopio. Sumado a esto se instalara un sistema de detección de conteo de fotones y una tarjeta FLIMbox (dominio de la frecuencia) para poder obtener información de tiempo de vida de los fluoroforos. 

Proyecto: “Microscopia de dos fotones resuelta en el tiempo de vida en el Hospital Universitario: un microscopio en el estado de arte para responder preguntas en biomedicina.”, financiado por CSIC Equipamiento pesado 2018.

Aquellos interesad@s en alguno de estos proyectos, enviar CV resumido (4 pag max) y carta intención (1 pag max) a:

Dr. Leonel Malacrida

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