Departamento de Fisiopatología

HOSPITAL DE CLÍNICAS "Dr. Manuel Quintela" - FACULTAD DE MEDICINA - UNIVERSIDAD DE LA REPÚBLICA

Microscopía Bifotónica

Unidad de Microscopia Avanzada y Bifotónica

Miembros de la Unidad de Microscopia Avanzada y Bifotónica

 

 

MALACRIDA DEF 1 761x280
Leonel Malacrida (PhD)
 Responsable 

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Equipo:

Ma José García (Estudiante de Maestría PEDECIBA)

Ana Laura Suarez (Tec. Anatomía Patológica) 

 

Lineas de investigación:

1- Proyectos impulsados por el desarrollo de tecnología, métodos y aplicaciones en el campo de la Biofotónica.

 

a) “Fluorescence Lifetime Assisted in vivo Detection of Skin Cancers with a Portable Point-of-Care Fiber Optical Device.”, financiación NIH P41-GM103540. PI's: Leonel Malacrida y Enrico Gratton. U$S 50000 

 

b) “Microscopia de dos fotones resuelta en el tiempo de vida en el Hospital Universitario: un microscopio en el estado de arte para responder preguntas en biomedicina.”, financiado por CSIC Equipamiento pesado 2018. PI's: Leonel Malacrida y Javier Hurtado. $U 38500000

 

 

 

2- Proyectos biologicos "guiados por hipotesis".

 

a) “Una aproximación a las enfermedades neurodegenerativas mediante microscopía y espectroscopia de fluorescencia in vivo. Rol de la segregación de fases líquido-líquido en la fisio(pato)logía celular.”, financiado por FCE Mod II 2018-ANII. PI: Leonel Malacrida. $U 1000000

 

b) “Microscopia no-lineal y por tiempo de vida en modelos experimentales de lesión pulmonar: Evaluación de su utilidad diagnostica a través de aprendizaje automático”, financiado por CSIC I+D 2018. PI: Leonel Malacrida. $U 1000000

 

 

2- Proyectos de Extension o desarrollo institucional.

 

a) "Cooperación para el desarrollo de capacidades en microscopia avanzada con miras a cooperación para el desarrollo de capacidades en microscopia avanzada con miras a constituir la red latinoamericana de microscopía", Fianaciado por el Fondo conjunto de cooperacion Mexico-Uruguay (AMEXCID-AUCI). Responsables: Andres Kamaid (IPMON), Christopher Wood (UNAM), Leonel Malacrida (UdelaR). U$S100000

 


Capacidades instrumentales de la UMAB

 

 1- Microscopio "home-buit" de dos fotones con resultución de tiempo de vida y FCS. Bloque epifluorescente Nikon Ti-S, laser pulsado basado en fibra 780 nm (Calmar), 2 dectectores pesudo conteo de fotones (GaAsP Hamamatsu), FLIMBos 320 (ISS), platina motorizada x/y (ASI), lente electrico (Optotune), CO2 y temperatura controlada, mesa óptica con aislación pasiva (TMC) escaner glavanometrico x/y ultrarápido (Cambridge Technologies).

  • FLIM
  • FRET
  • Phasor plots
  • FCS (single point, line, circular, diffusion map)
  • RICS (crossRICS)
  • N&B (crossN&B)
  • pCF (pCOMB)
  • 2D y 2D Particle Tracking 
  • epifluorescence (camera based)

2- Instrumento basado en Fibras ópticas para medidas de tiempo de vida y espectral. Detector Hamamatsu de 2x2, A320 fastFLIMbox (ISS), Laser Diodo 370 nm modulado hasta 300MHz (ISS), Laser pulsado 355 nm (Markettech), Fibras opticas (ThorLabs).

3- Espectrometros de alta resolución y velocidad para diffuse optical spectroscopic imaging (DOSI) . HR4000 y 2x USB200 (Ocean Optics).

 

 

 
Cursos dicatados:

 

 

1er Workshop de Micrsocopia de Fluorescencia Avanzada y Biofotónica.

25 al 28 de Noviembre de 2019.

Unidad de Microscopia Avanzada y Bifotónica

Hospital de Clínicas -  Universidad de la República

Banner 1er workshop 2019


Organizador: Dr. Leonel Malacrida

Profesores Internacionales invitados:

Profesores invitados locales:

 

Lunes 25 de Noviembre

08:30-09:00 – Palabras inaugurales e introducción al curso. Leonel Malacrida

09:00-09:45 – Lecture 1. Leonel Malacrida. Introducción a la fluorescencia y métodos fluorescentes.

09:45-10:30 – Lecture 2. Leonel Malacrida: Fundamentos de la instrumentación avanzada de fluorescencia y microscopia de fluorescencia.

Break

11:00-11:45 – Lecture 3. Enrico Gratton: Introducción a la Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH)

Almuerzo

13:30-14:00 – – Charla de aplicaciones #1. Susana Sánchez: Detección de proteínas ribosomales en levaduras mediante análisis de PCH.

14:00 – 14:45: Lecture 4. Enrico Gratton: Aplicaciones de Raster image correlation spectroscopy (RICS) para medir la difusión molecular in vivo.

14:45-15:30 – Lecture 5. Enrico Gratton: Análisis de Numero y Brillo (N&B) para estudiar la oligomerización y concentración de proteínas en la célula.

Break

16:30 – 17:15 - Lecture 6. Leonel Malacrida: El método de pair-correlation y sus aplicaciones (pCF) para descifrar barreras y obstáculos a la difusión in vivo.

 

Martes 26 de Noviembre

09:00-09:45 – Lecture 7. David Jameson: Introducción a la medida de tiempo de vida y los gráficos de Fasores.

09:45-10:30 – Lecture 8. Enrico Gratton: Los gráficos de Fasores para el análisis e interpretación de FLIM y FRET.

Break

11:00-11:45 – Lecture 9. Leonel Malacrida: Los fasores espectrales y sus aplicaciones para el análisis de microscopia hiperespectral.

11:45-12:15 – Charla de aplicaciones #2. Susana Sánchez: Aplicaciones de FLIM-Fasores para responder preguntas biologicas.

Almuerzo

13:30-14:15 – Charla de aplicaciones #3. Enrico Gratton: Aplicaciones de FLIM-Fasores para estudios del metabolismo celular en Biomedicina.

14:15 – 14:35 - Charla de aplicaciones # 4. Leonel Malacrida: Concentración absoluta in vivo de NADH. FLIM-Phasor y metabolismo, algunas consideraciones.

14:45 – 15:45 - – Simulaciones de FCS y análisis de datos RICS y N&B. Leonel Malacrida – Susana Sanchez - Enrico Gratton.

Break

16:30-17:30 – Continuación de las simulaciones de FCS y análisis de datos RICS y N&B.

 

Miércoles 27 de Noviembre

09:00-09:45 – Lecture 10. Enrico Gratton: Seguimiento de partícula única en 3D y sus aplicaciones.

09:45-10:30 – Lecture 11. Leonel Malacrida: Microscopia de iluminación en lamina (SPIM) y sus aplicaciones.

Break

11:00-11:30 – Charla de aplicaciones #5 - David Jameson: Aplicaciones de N&B en la oligomerización de proteínas en células in vivo.

11:30: - 12:00 - Charla de aplicaciones #6. Enrico Gratton: Microscopía DIVER para aplicaciones en imágenes de tejidos en profundidad y microscopia no lineal (generación de armónicos).

Almuerzo

13:30-15:30 – Entrenamiento en FLIM/Hiperespectral/Phasor con simulaciones en computadora. Leonel Malacrida – Susana Sanchez - Enrico Gratton.

15:30-17:30 – Sección de poster con los estudiantes participantes (se les solicitara a los estudiantes que presente un poster de su proyecto de investigación).

 

Jueves 28 de Noviembre

09:00-09:30 – Charla de aplicaciones #7. Andrés Saraleguí. Observando tejidos en profundidad: Microscopía Multifotónica y Aclaramiento de muestras.

09:30-10:00 – Charla de aplicaciones #8. Susana Sánchez: Fluctuaciones de la función de GP y su aplicación en el estudio de la dinámica de membranas.

Break

10:30-11:00 – Charla de aplicaciones #9. Florencia Irigoín. Dinámica de las membranas en la cilia primaria por microscopia hiperespectral y fluorescencia de LAURDAN.

11:00-11:30 – Charla de aplicaciones #11. Federico Lecumberry. Procesamiento de señales y aprendizaje automático aplicado a imágenes biomédicas.

11:30-12:00 – Charla de aplicaciones #12. Julia Alonso. Óptica Computacional aplicada a la Microscopía de Fluorescencia.

Almuerzo

13:30 – 14:00 - Charla de aplicaciones #13. Leonel Malacrida: Ensayo de iMSD y 2D-pCF para el análisis de difusión de moléculas dentro de la célula in vivo.

14:00 – 15:00 - Lecture 12. Cierre del Workshop y Seminario especial. David Jameson: Una nano-historia acerca de la fluorescencia.


Estudiantes participantes:

1 Alberto Ezequiel Rafael Ponce Facultad de Medicina
2 Alejandro Silva Facultad de Ingeniería
3 Ana Laura Suárez Hospital de Clínicas
4 Andres Di Paolo IIBCE
5 Carolina Oliveira Facultad de Ciencias
6 Daniel Andres Palacio Universidad de Concepción, Chile
7 Diego Hernández IIBCE
8 Estefania Silveyra Facultad de Odontologia
9 Eugenia Isasi Facultad de Medicina
10 Inés Marmisolle Facultad de Medicina
11 Ines  Rauschert IIBCE
12 Jennyfer Martinez Facultad de Medicina
13 Joao Aguilar Universidad de concepción, Chile
14 Juan Llaguno Facultad de Ingeniería
15 Juan Carlos Rosillo IIBCE
16 Lourdes Echarte Hospital de Clínicas
17 Mai  Sandra Facultad de Medicina
18 Marcos  Nieves IPMON
19 María del Pilar Irigoyen Facultad de Medicina
20 María Eugenia Cruces IPMON
21 María José García Hospital de Clínicas
22 María Laura Herrera IIBCE
23 Mariana Di Doménico Firpi Facultad de Medicina
24 Marset María Virginia  Facultad de Medicina
25 Martín Figares IIBCE
26 Natalia Marquisá Hospital de Clínicas
27 Pablo Liddle IIBCE
28 Paola  Lepanto IPMON
29 Vanesa Pereira Facultad de Odontologia

 

Apoyos para el curso:

apoyos

 

Foto final de curso

Foto grupal 2019

 

 

Publicaciones

 

2020
Barriers to diffusion in cells: visualization of membrane-less particles in the nucleus. 

Leonel Malacrida, Per Niklas Hedde, Belen Torrado, Enrico Gratton. The Biophysicist. Accepted 

CAPRYDAA, an anthracene dye analog to LAURDAN: a comparative study using cuvette and microscopy

Vicente Castro-Castillo, Javier Gajardo, Catalina Sandoval-Altamirano, Enrico Gratton, Susana Sanchez, Leonel Malacrida*, German Gunther*
Journal of Materials Chemistry B. 2020 Jan 7;8(1):88-99. 
(* autor correspondiente)


2019

 

Determination of the metabolic index using the fluorescence lifetime of free and bound nicotinamide adenine dinucleotide using the phasor approach

S Ranjit#, L Malacrida#, M Stakic, E Gratton
J Biophotonics. 2019 Nov;12(11):e201900156.
(# primer autor en pie de igualdad)

 

The DIVER Microscope for Imaging in Scattering Media

A Dvornikov, L Malacrida, E Gratton
Methods and protocols 2 (2), 53. 2019

 

StarD5: an ER stress protein regulates plasma membrane and intracellular cholesterol homeostasis

Daniel Rodriguez-Agudo, Leonel Malacrida, Genta Kakiyama, Tavis Sparrer, Carolina Fortes, Michael Maceyka, Mark A Subler, Jolene J Windle, Enrico Gratton, William M Pandak, Gregorio Gil
Journal of lipid research 60 (6), 1087-1098. 2019

 

A novel nitroalkene‐α‐tocopherol analogue inhibits inflammation and ameliorates atherosclerosis in Apo E knockout mice

Jorge Rodriguez‐Duarte, Germán Galliussi, Rosina Dapueto, Jessica Rossello, Leonel Malacrida, Andrés Kamaid, Francisco J Schopfer, Carlos Escande, Gloria V López, Carlos Batthyány
British journal of pharmacology 176 (6), 757-772. 2019

 

2018

 

Differences between FLIM phasor analyses for data collected with the Becker and Hickl SPC830 card and with the FLIMbox card

S Ranjit#, L Malacrida#, E Gratton
Microscopy research and technique 81 (9), 980-989. 2018

(# primer autor en pie de igualdad)

Fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging data using the phasor approach

S Ranjit#, L Malacrida#, DM Jameson, E Gratton
Nature protocols 13 (9), 1979. 2018

(# primer autor en pie de igualdad)

LAURDAN fluorescence and phasor plots reveal the effects of a H2O2 bolus in NIH-3T3 fibroblast membranes dynamics and hydration

L Malacrida*, E Gratton*
Free Radical Biology and Medicine 128, 144-156. 2018
(* autor correspondiente)
PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells
Seong M Kim, Tricia T Nguyen, Archna Ravi, Peter Kubiniok, Brendan T Finicle, Vaishali Jayashankar, Leonel Malacrida, Jue Hou, Jane Robertson, Dong Gao, Jonathan Chernoff, Michelle A Digman, Eric O Potma, Bruce J Tromberg, Pierre Thibault, Aimee L Edinger
Cancer discovery 8 (7), 866-883. 2018
Comparison between iMSD and 2D-pCF analysis for molecular motion studies on in vivo cells: The case of the epidermal growth factor receptor
L Malacrida, E Rao, E Gratton
Methods 140, 74-84. 2018
Visualization of barriers and obstacles to molecular diffusion in live cells by spatial pair-cross-correlation in two dimensions
L Malacrida, PN Hedde, S Ranjit, F Cardarelli, E Gratton
Biomedical optics express 9 (1), 303-321. 2018
Alteration in fluidity of cell plasma membrane in Huntington disease revealed by spectral phasor analysis
S Sameni, L Malacrida, Z Tan, MA Digman
Scientific reports 8 (1), 734. 2018
Ver corrección:
Publisher Correction: Alteration in Fluidity of Cell Plasma Membrane in Huntington Disease Revealed by Spectral Phasor Analysis
S Sameni et al. Sci Rep 8 (1), 6060.  PMID 29643420.

2017

 

sideSPIM–selective plane illumination based on a conventional inverted microscope

PN Hedde, L Malacrida, S Ahrar, A Siryaporn, E Gratton
Biomedical optics express 8 (9), 3918-3937. 2017

 

Spectral phasor analysis reveals altered membrane order and function of root hair cells in Arabidopsis dry2/sqe1-5 drought hypersensitive mutant

F Sena, M Sotelo-Silveira, S Astrada, MA Botella, L Malacrida, O Borsani
Plant physiology and biochemistry 119, 224-231. 2017

 

A multidimensional phasor approach reveals LAURDAN photophysics in NIH-3T3 cell membranes

L Malacrida, DM Jameson, E Gratton
Scientific reports 7 (1), 9215. 2017

 

2016

Spectral phasor analysis of LAURDAN fluorescence in live A549 lung cells to study the hydration and time evolution of intracellular lamellar body-like structures

L Malacrida*, S Astrada, A Briva, M Bollati-Fogolín, E Gratton, LA Bagatolli*
Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes 1858 (11), 2625-2635. 2016

(* autor correspondiente)

Measurements of absolute concentrations of NADH in cells using the phasor FLIM method

N Ma, MA Digman, L Malacrida, E Gratton
Biomedical optics express 7 (7), 2441-2452. 2016

2015 y anteriores

 

Model-free methods to study membrane environmental probes: a comparison of the spectral phasor and generalized polarization approaches

L Malacrida, E Gratton, DM Jameson
Methods and applications in fluorescence 3 (4), 047001. 2015

Ver corrección:

Erratum: Model-free methods to study membrane environmental probes: a comparison of the spectral phasor and generalized polarization approaches (2015 Methods Appl. Fluoresc. 3 …

L Malacrida, E Gratton, DM Jameson
Methods and Applications in Fluorescence 4 (1), 019601



Journals cover

Cover MRT 2018

On the cover: The cover image is based on the Research Article Differences between FLIM phasor analyses for data collected with the Becker and Hickl SPC830 card and with the FLIMbox card by Suman Ranjit et al., DOI: https://doi.org/10.1002/jemt.23061.











Patentes

 Selective plane illumination in the conventional inverted microscope geometry by side illumination

PN Hedde, L Malacrida
US Patent App. 16/483,659

Entrevistas y presentaciones públicas

Presentación en la celebración de los 30 años de la Licenciatura en Bioquímica y los 20 años del Instituto de Química Biológica, de la Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

Link aquí

Entrevista el Dr. Leonel Malacrida SobreCiencia, Radio Uruguay 1050 AM. 2019

El primer microscopio de dos fotones del país, comenzará a funcionar este año.

 

Entrevista el Dr. Leonel Malacrida SobreCiencia, Radio Uruguay 1050 AM. 2018

El Clínicas tendrá el primer microscopio de dos fotones del país

 

Llamado a estudiantes de la UMAB

Se llama a interesad@s para unirse al equipo de trabajo del UMAB, los objetivos de investigación del grupo tiene un corte sustancial de transdisciplinariedad por lo cual se buscan candidatos con interés de trabajar en las fronteras de la Biología Celular/Molecular, Bioquímica, Biomedicina, Biofotónica y Bioingeniería.

 

Se contemplan la realización de tesis de grado, posgrado y/o estancias postdoctorales.

 

Los proyectos en curso son los siguientes:

 

 

1-Caracterización biofísica in vivo por herramientas de microscopia avanzada de fluorescencia de las separaciones de fase liquido-liquido y liquido-solida de FUS (Fused in Sarcoma, RNA binding protein) como responsable del desarrollo y progresión de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).

Se realizaran líneas neuronales con expresión estable de versiones fusionadas de FUS (así como mutaciones puntuales) a proteínas fluorescentes y se analizaran las características fisicoquímicas de las fases liquida-liquida y liquida-solida por sensores de relajación por entorno (actividad de agua con ACDAN) y viscosidad (rotor molecular TPAP). Además se estudiaran por microscopio bifotónica y de tiempo de vida la influencia del estado metabólico celular en la progresión de la segregación líquido-solido como mecanismo de la fisiopatología de la FUS.  

Proyecto “Una aproximación a las enfermedades neurodegenerativas mediante microscopía y espectroscopia de fluorescencia in vivo. Rol de la segregación de fases líquido-líquido en la fisio(pato)logía celular.”, financiado por FCE 2018-ANII.

 

2-Desarrollo de nuevos métodos de diagnostico y caracterización de la Lesión pulmonar aguda por microscopia de dos fotones y resuelta en el tiempo de vida (FLIM).

Se relaciona con el uso de la autofluorescencia (NADH/FAD+) como indicador del metabolismo tisular, generación de segundo y tercer armónico, imagen en tejido con dispersión, etc. En un modelo experimental de ratones C57BL/6 con lesión pulmonar aguda por instilación pulmonar de lipopolisacarido bacteriano. Se pretende incorporar herramientas de inteligencia artificial (machine learning) al análisis y procesamiento de imágenes de FLIM.

Proyecto “Microscopia no-lineal y por tiempo de vida en modelos experimentales de lesión pulmonar: Evaluación de su utilidad diagnostica a través de aprendizaje automático”, financiado por CSIC I+D 2018

 

3- Desarrollo y aplicación un nuevo dispositivo basado en fibras ópticas para la caracterización in vivo del metabolismo tisular por la autofluorescencia.

El proyecto comprende el armado, puesta a punto y aplicación de este nuevo dispositivo de imagen con resolución de tiempo de vida e hiperespectral utilizando arreglo de detectores con conteo de fotones y laser UV pulsado/modulado. El instrumento tiene como objetivo ser utilizado en in vivo como sondas intra-vital, así como en la definición de márgenes en cirugía oncologica.

Proyecto “Fluorescence Lifetime Assisted in vivo Detection of Skin Cancers with a Portable Point-of-Care Fiber Optical Device.”, financiación NIH P41-GM103540

 

4-Ensamblado y puesta a punto de un microscopio de dos fotones con detección de conteo de fotones y resolución de tiempo de vida.

El primer microscopio bifotónico del Uruguay será ensamblado a partir de la adquisición de sus componentes (laser, glavo-scanner, detectores, FLIMbox card), por lo cual será un proyecto con un claro corte ingenieril y con la posibilidad de cubrir todos los aspectos que hacen al funcionamiento de un microscopio. Sumado a esto se instalara un sistema de detección de conteo de fotones y una tarjeta FLIMbox (dominio de la frecuencia) para poder obtener información de tiempo de vida de los fluoroforos. 

Proyecto: “Microscopia de dos fotones resuelta en el tiempo de vida en el Hospital Universitario: un microscopio en el estado de arte para responder preguntas en biomedicina.”, financiado por CSIC Equipamiento pesado 2018.

 

Aquellos interesad@s en alguno de estos proyectos, enviar CV resumido (4 pag max) y carta intención (1 pag max) a:

Dr. Leonel Malacrida

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